該模型的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變?cè)u(píng)分值，該模型與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的經(jīng)典cornell模型類似，但是cronell模型的問(wèn)題在于模型潛伏期荷菌量過(guò)高，復(fù)發(fā)期3-9個(gè)月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問(wèn)題，模型均一，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過(guò)低也不過(guò)高），周期明顯縮短，由3-9個(gè)月不等的周期縮短到比較穩(wěn)定的10周，便于應(yīng)用。

該模型不僅可以用于潛伏及復(fù)發(fā)的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復(fù)發(fā)期研究疾病機(jī)制，同時(shí)可以用于評(píng)價(jià)潛伏感染的預(yù)防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動(dòng)物模型的制備的設(shè)計(jì)得到研究所IACUC委員會(huì)的批準(zhǔn)，人員都是訓(xùn)練有素的研究人員和實(shí)驗(yàn)人員，全程在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，完全按照模型制備和檢測(cè)的一系列SOP操作進(jìn)行，遵守生物安全操作要求，無(wú)安全事故。

1小鼠體重的變化結(jié)果

根據(jù)十周連續(xù)觀察體重后，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的對(duì)照組小鼠體重按照正常的規(guī)律增加，即從實(shí)驗(yàn)開始的18~20g到感染第10周后的21~22g左右；實(shí)驗(yàn)感染小鼠的體重均有不同程度的下降。

感染途徑的不同體重變化的情況隨之不同，C57BL/J小鼠尾靜脈注射組和腹腔注射組的體重均在感染后第7周開始下降，其中尾靜脈注射下降幅度較大。BALB/c小鼠體重下降是從感染后第6周開始下降。

感染劑量的不同體重變化也有較大的變化，感染劑量為105CFU的小鼠體重變化，C57/BL/J是尾靜脈感染后第7周開始有明顯下降（約3g左右），C57/BL/J是腹腔感染后體重下降的幅度較小在1g左右，BALB/c小鼠體重下降是從感染后第6周開始下降。感染劑量為104CFU、103CFU體重還是在上升，與對(duì)照組比較沒(méi)有明顯區(qū)別。

體重變換曲線見圖1、2：

圖1 C57BL/6小鼠尾靜脈注射感染結(jié)核分支桿菌后體重變化曲線

圖2BALB/c小鼠尾靜脈注射感染結(jié)核分支桿菌后體重變化曲線

2 小鼠感染后大體病理變化

感染后6周解剖時(shí)病理變化，與對(duì)照組相比，各組小鼠的脾臟肺臟均沒(méi)有眼觀變化。

小鼠在感染8周時(shí)，不同品系小鼠和不同劑量組的小鼠在肺臟和脾臟均有不同程度的眼觀病理變化。解剖發(fā)現(xiàn)主要在肺臟有不同程度秫米大小的結(jié)核病灶，且脾臟腫大。小鼠感染8周后解剖病理變化：BABL/c和C57BK/J對(duì)照組小鼠均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理變化。BABL/c和C57BK/J小鼠的尾靜脈注射組均有肉眼可見病變?cè)睢57BK/J小鼠的腹腔注射組沒(méi)有肉眼可見的病理變化。8周時(shí)，與對(duì)照組相比，BABL/c小鼠的低劑量組103、104、105肺臟均已經(jīng)有病理變化，脾臟出現(xiàn)腫大;C57BK/J小鼠低劑量組沒(méi)有變化，104、105肺臟均有病理變化，且脾臟沒(méi)有變化。

小鼠感染10周后解剖病理變化：BABL/c和C57BK/J對(duì)照組小鼠均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理變化。與對(duì)照組相比，BABL/c和C57BK/J小鼠的尾靜脈注射組103、104、105均有肉眼可見病變?cè)睢57BL/J小鼠的腹腔注射組在10周時(shí)也出現(xiàn)了肉眼可見的病理變化。10周時(shí)，與對(duì)照組相比，BABL/c小鼠的103、104、105各劑量組肺臟均已經(jīng)有嚴(yán)重的病理變化，有粟粒樣結(jié)核結(jié)節(jié)且主要特點(diǎn)是分布在全肺不同的部位，脾臟出現(xiàn)腫大也是一個(gè)主要的病理變化指標(biāo)；C57BL/J小鼠103、104、105肺臟也均出現(xiàn)了病理變化，也有粟粒樣結(jié)核結(jié)節(jié)，但主要分布在肺葉的邊緣。脾臟與對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯的變化。

結(jié)果見圖3、4：

圖3 對(duì)照組小鼠解剖眼觀肺臟病理變化

CW:c57小鼠BW:BABL/c

圖4C57BL/6小鼠尾靜脈注射感染結(jié)核分支桿菌后解剖眼觀肺臟病理變化

3小鼠的組織病理變化

正常對(duì)照組的肺臟和脾臟未見明顯病理改變。10^{4CFU、105CFU、106CFU組內(nèi)均有不同程度肺組織內(nèi)血管旁淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織內(nèi)肉芽腫，脾臟肉芽腫，肝組織內(nèi)肉芽腫。結(jié)果見圖5}

圖5 小鼠病理切片HE染色結(jié)果

A:正常肺臟；E:正常脾臟；B:肺組織內(nèi)血管旁淋巴細(xì)胞浸潤(rùn) C: 肺組織內(nèi)肉芽腫；F: 脾臟肉芽腫；G: 肝組織內(nèi)肉芽腫

4 小鼠荷菌量變化

感染后6周時(shí)，解剖小鼠肉眼觀察，脾臟、肺臟均沒(méi)有明顯肉眼可見的病變?cè)睢Ｃ拷M的正常對(duì)照組均無(wú)結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。6周解剖脾臟細(xì)菌分離培養(yǎng)均有結(jié)果（除去C57BL/J小鼠腹腔注射104有一只為陰性）。證明以103為感染劑量尾靜脈注射均可在6周時(shí)感染BABL/c、C57BL/J小鼠。脾臟細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果見下表1：

感染后8周時(shí)，解剖后對(duì)照組小鼠肉眼觀察，脾臟、肺臟均沒(méi)有明顯肉眼可見的病變?cè)睿拷M的正常對(duì)照組均無(wú)結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。但8周解剖時(shí)，在C57BL/J尾靜脈注射組104、105組已經(jīng)在肺臟和脾臟出現(xiàn)眼觀的病理變化，BABL/c小鼠尾靜脈注射組103、104和105組均在肺臟和脾臟出現(xiàn)眼觀的病理變化。但8周解剖脾臟細(xì)菌分離培養(yǎng)均有結(jié)果（除去BABL/c小鼠尾靜脈注射104和C57BL/J腹腔注射組103各有一只為陰性）。證明以103為感染劑量尾靜脈注射均可在8周時(shí)感染BABL/c、C57BL/J小鼠，腹腔注射可感染BABL/c小鼠。細(xì)菌分離培養(yǎng)顯示組織荷菌量高于6周。

感染后10周時(shí)，解剖后對(duì)照組小鼠肉眼觀察，脾臟、肺臟均沒(méi)有肉眼可見的病變?cè)睿拷M的正常對(duì)照組均無(wú)結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。在C57BL/J尾靜脈注射組104、105、106組已經(jīng)在肺臟和脾臟出現(xiàn)眼觀的病理變化，BABL/c小鼠尾靜脈注射組104和105、106組均在肺臟和脾臟出現(xiàn)眼觀的病理變化，C57BL/J腹腔注射組104、105、106組已經(jīng)在肺臟和脾臟出現(xiàn)眼觀的病理變化。細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示組織荷菌量高于8周。

表1 小鼠感染結(jié)核分支桿菌后6周脾臟細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

1實(shí)驗(yàn)用小鼠的選擇：

選擇年齡6~8周齡，體重16~20g，SPF級(jí)雌性C57BL/6和BALB/c小鼠（提供廠商:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所）。動(dòng)物使用申請(qǐng)?zhí)?中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)（批準(zhǔn)號(hào)：MC—09-2003）。

2飼養(yǎng)環(huán)境：

動(dòng)物生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室（ABSL-3）；溫濕度范圍：18-28℃；相對(duì)濕度：40-70％；換氣次數(shù)：機(jī)械送排風(fēng)；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清潔消毒：用具、籠架等在投入使用前進(jìn)行消毒；籠具種類及飼育密度：小鼠籠，12只一籠；

3飼養(yǎng)條件

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所華阜康有限公司小鼠專用飼料,自由采食；墊料為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所華阜康有限公司，定期更換；飲水；普通自來(lái)水經(jīng)過(guò)高壓(121℃,30min)，自由飲用。

4實(shí)驗(yàn)用小鼠的分組及感染

實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)大組，第一組為C57BL/6尾靜脈注射組、第二組為C57BL/6腹腔注射組和第三組為BALB/c尾靜脈注射組，其中每一個(gè)大組中分四個(gè)小組：正常對(duì)照組(生理鹽水)、高劑量組（1X10^{6CFU）、中劑量組（1X105 CFU）和低劑量組（1X104 CFU），每組12只小鼠，共144只小鼠。}

5感染用菌株

用結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv株或結(jié)核耐藥株（內(nèi)部編號(hào)94789）。

6觀察

小鼠在進(jìn)入ABSL-3實(shí)驗(yàn)室之后,觀察4~5天后,進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。感染后，觀察每天感染小鼠的臨床癥狀，并每周稱取小鼠體重，觀察不同感染方式和不同感染劑量小鼠體重的變化規(guī)律。

7病理檢查和組織荷菌量計(jì)數(shù)

分別在感染后6周、8周和10周，每組解剖3只小鼠，分別無(wú)菌取小鼠1/2脾臟、1/2肺臟，無(wú)菌研磨后接種L-J斜面進(jìn)行結(jié)核分支桿菌的分離培養(yǎng)。并將同一組織的剩余部分固定在10%福爾馬林中，進(jìn)行病理切片。

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌（結(jié)核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結(jié)核感染通常會(huì)累及肺、淋巴系統(tǒng)及其它多組織器官。除少數(shù)發(fā)病急促外，臨床上多呈慢性過(guò)程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)。感染后潛伏期4～8周，其中80%發(fā)生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發(fā)感染。

排菌的肺結(jié)核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數(shù)的受感染者沒(méi)有病癥，稱為潛伏結(jié)核感（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會(huì)發(fā)展至活動(dòng)性結(jié)核；若無(wú)適當(dāng)治療，一個(gè)活動(dòng)病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過(guò)50%。若潛伏感染者同時(shí)罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病發(fā)機(jī)率。

肺結(jié)核病程較復(fù)雜，臨床分型有：1、原發(fā)型肺結(jié)核(Ⅰ型): 肺內(nèi)滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結(jié)腫大的啞鈴狀改變的原發(fā)綜合征。兒童多見，僅表現(xiàn)為肺門和縱隔淋巴結(jié)腫大。 2、血型播散型肺結(jié)核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結(jié)核及亞急性、慢性血型播散型肺結(jié)核。 3、繼發(fā)型肺結(jié)核(Ⅲ型):可以出現(xiàn)以增殖為主、浸潤(rùn)為主、干酪病變?yōu)橹骰蛞钥斩礊橹鞯榷喾N病理改變。

結(jié)核菌進(jìn)入機(jī)體后，被巨噬細(xì)胞吞噬，結(jié)核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結(jié)核發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。結(jié)核病從感染、發(fā)病到轉(zhuǎn)歸均與多數(shù)細(xì)菌性疾病有顯著不同，宿主反應(yīng)具有特殊意義，反應(yīng)分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結(jié)核菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細(xì)胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結(jié)核菌的命運(yùn)各異。2.T細(xì)胞反應(yīng)期，由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫（CMI）和遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)（DTH）在此期形成，從而對(duì)結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結(jié)核菌可以持續(xù)存活，細(xì)菌與宿主處于共生狀態(tài)。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認(rèn)為是結(jié)核桿菌持續(xù)存在的主要場(chǎng)所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細(xì)菌不能增殖。宿主的免疫機(jī)制亦是抑制細(xì)菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結(jié)核菌的重新活動(dòng)和增殖。4.細(xì)胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長(zhǎng)能力、但不繁殖的結(jié)核菌。干酪灶一旦液化便給細(xì)菌增殖提供了理想環(huán)境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結(jié)核桿菌亦足以突破局部免疫防御機(jī)制，引起播散。

結(jié)核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結(jié)核性結(jié)節(jié)，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細(xì)胞、單核細(xì)胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結(jié)核結(jié)節(jié)及結(jié)合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變?yōu)楦衫覙痈淖儭＝Y(jié)核性炎癥的主要特是上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)及郎格漢斯細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室痰培養(yǎng)為菌陽(yáng)性，抗酸染色可見細(xì)長(zhǎng)略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發(fā)病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結(jié)結(jié)核合稱為原發(fā)綜合癥，X線影像學(xué)上的典型表現(xiàn)為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結(jié)核菌素皮試轉(zhuǎn)陽(yáng)，95%的健康感染者原發(fā)綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復(fù)燃而發(fā)病,結(jié)核病起病緩慢，病程較長(zhǎng)。