給予動(dòng)物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測(cè)，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺(tái)潛伏期顯著性延長(zhǎng)，避暗錯(cuò)誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對(duì)CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對(duì)于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動(dòng)物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長(zhǎng)20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對(duì)飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，以避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過(guò)不同的刺激因子對(duì)老鼠造成慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激模型，通過(guò)水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對(duì)于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級(jí)老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過(guò)除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無(wú)異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）藥品與試劑：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多巴胺（DA）、乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）來(lái)自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美國(guó)莫州）。 （2）儀器： ① 行為學(xué)檢測(cè)：水迷宮儀器 ② 機(jī)制檢測(cè)：全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。2 評(píng)價(jià)方法 （1） 行為學(xué)評(píng)價(jià): ① 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris Water Maze test, MWM test）采用大鼠水迷宮計(jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)進(jìn)行。大鼠水迷宮為直徑180cm，高60cm 圓形的水池。在水池壁上標(biāo)明4 個(gè)點(diǎn)，并據(jù)此將水池分為四個(gè)象限，于其中一象限中心置一直徑為10cm，高30cm 的鐵質(zhì)圓形平臺(tái)，水面高于平臺(tái)1cm，水溫控制在(25±2)℃。水迷宮測(cè)試分為兩個(gè)階段，即①定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 天，每只動(dòng)物每天3 個(gè)象限（實(shí)臺(tái)象限除外），將大鼠面向池壁放入水中，記錄1.5 min 內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間(尋臺(tái)潛伏期)。若大鼠入水后1.5 min 內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其置于平臺(tái)上并停留30s，尋臺(tái)潛伏期記錄為1.5 min。② 空間探索實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，將大鼠面向水壁從對(duì)角象限入水放入池內(nèi)，記錄1.5 min 內(nèi)，動(dòng)物在實(shí)臺(tái)象限的游程、時(shí)間等指標(biāo)。

② 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)

避暗實(shí)驗(yàn)前一天，將動(dòng)物頭部背向電動(dòng)門自明室放入，任其在明暗室內(nèi)自由活動(dòng)以熟悉環(huán)境。5 min 后，取出，放回原籠。實(shí)驗(yàn)分為記憶獲得和鞏固兩個(gè)階段，均于給藥1 小時(shí)后開始檢測(cè)。記憶獲得階段：將動(dòng)物頭部背向電動(dòng)門自暗室放入，暗室電壓幅度為39v。檢測(cè)時(shí)間為5 min。軟件自動(dòng)記錄5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)、暗室時(shí)間及暗室路程。24 小時(shí)后，進(jìn)行記憶鞏固實(shí)驗(yàn)：將動(dòng)物頭部背向電動(dòng)門自明室放入，即開始實(shí)驗(yàn)，電壓幅度為39 v。軟件自動(dòng)記錄5 min 內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)、入暗潛伏期、暗室時(shí)間及暗室路程。

③皮毛狀態(tài)測(cè)試

皮毛狀態(tài)測(cè)試在實(shí)驗(yàn)前及應(yīng)激刺激結(jié)束后各測(cè)試一次。皮毛狀態(tài)測(cè)試部位包括頭、頸、背部、腹部、前后爪、尾巴、生殖器七個(gè)部位。皮毛整潔，計(jì)0分，皮毛臟亂，計(jì)1分。皮毛狀態(tài)指數(shù)=計(jì)分總數(shù)/部位數(shù)。

（2）機(jī)制的檢測(cè)

①CUMS對(duì)大鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

采用實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)方法-LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：色譜柱為 TSK-GEL Amide-80，柱溫35 ℃；以乙腈–水 (含6 mM HCOONH4)（67.5 : 32.5）為流動(dòng)相，0.2 mL/min 流速。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源；正離子模式檢測(cè)；電噴霧電壓為4500V；信號(hào)采集方式為多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；GS1：50 psi；GS2：50 psi；TEM：450℃。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 DA， NE，5-HT，Ach，GABA，Glu，DHBA 各 1 mg，用含0.2% 甲酸的甲醇：水(1：1)配制成 1 mg/mL 的儲(chǔ)備液（-80℃保存），臨用前分別吸取各神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 μL，加入860 μL 含 0.2% 甲酸的甲醇水（1:1），配制成20 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋混勻，然后分別稀釋至1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2，0.1 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋后每200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入300 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL。標(biāo)準(zhǔn)溶液均在臨用前配制。

測(cè)定方法：組織稱重，向EP 管中加入200 μl 純水。用超聲破碎儀進(jìn)行勻漿，后加入400 μL含0.2%甲酸乙腈，放于-20℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。次日從冰箱內(nèi)取出樣品，在4℃離心12000r/min，10min，各取上清液200 μL，加內(nèi)標(biāo)20μL(300μg/mL DHBA)，將樣品50μl 注入LC-MS/MS 進(jìn)行分析。

②CUMS對(duì)小鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

方法同大鼠。

（3）統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）形式表示。采用one-way ANOVA 進(jìn)行組內(nèi)比較，使用最小顯著差數(shù)法（LSD）多重比較方法比較兩組間差異，當(dāng)P <0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3. 結(jié)果

（1）CUMS對(duì)大鼠的影響

① CUMS對(duì)大鼠體重的影響

CUMS 模型組大鼠在應(yīng)激發(fā)生第2、3、4、5 周后體重較正常組明顯下降（P<0.01）。西酞普蘭組未能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激因素導(dǎo)致的體重下降。

② CUMS對(duì)大鼠水迷宮的影響

前5天的定位航行中，CUMS大鼠從第二天起尋臺(tái)潛伏期比正常大鼠長(zhǎng)（P<0.05）。在第六天的空間探索實(shí)驗(yàn)中CUMS大鼠與正常大鼠相比，跨平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少（P<0.05）。

（2）CUMS對(duì)小鼠的影響

①CUMS對(duì)小鼠體重的影響

隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，CUMS模型組體重增加緩慢，第5周時(shí)，模型組體重明顯下降，與正常組相比，具有顯著性差異。

③ CUMS對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

結(jié)果顯示，避暗實(shí)驗(yàn)記憶鞏固階段，CUMS模型小鼠入暗次數(shù)及在暗室中的時(shí)間和路程均明顯增加，與正常組相比，具有顯著性差異（P<0.01）。圖3 CUMS模型對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響（mean±SEM ，n=12，**p<0.01，與正常組比較） （3）機(jī)制檢測(cè)結(jié)果 ① CUMS對(duì)大鼠前額皮層組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響

CUMS 模型組前額皮層5-HT含量較正常組明顯下降（P<0.01），模型組前額皮層NE含量較正常組明顯下降（P<0.05）

將提取自亨廷頓病人的成纖維細(xì)胞（huntingtin基因內(nèi)CAG重復(fù)序列達(dá)143）通過(guò)腦立體定位注射的方法注射到恒河猴腦室內(nèi)（成年模型動(dòng)物注射到第三腦室，新生模型動(dòng)物注射到側(cè)腦室），從而建立亨廷頓病的恒河猴模型。成年模型動(dòng)物選擇雄性、年齡4-8周歲、體重6-8公斤的恒河猴。新生模型動(dòng)物選擇出生1-4天、體重400-600克的恒河猴。每只動(dòng)物注射100μl，1×107個(gè)細(xì)胞。

取物試驗(yàn)（Object retrieval task）

在腦立體定位注射人成纖維細(xì)胞手術(shù)后，通過(guò)取物試驗(yàn)檢測(cè)成年模型組和對(duì)照組動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能水平。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，（A）注射HD患者成纖維細(xì)胞后，成年模型組動(dòng)物在取物訓(xùn)練過(guò)程中出現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)錯(cuò)誤數(shù)量無(wú)明顯差異，（B）成年模型組動(dòng)物取物訓(xùn)練過(guò)程中出現(xiàn)的認(rèn)知錯(cuò)誤無(wú)明顯差異，（C）各組動(dòng)物一次嘗試即正確完成的成功率無(wú)明顯差異。結(jié)果反映，成年模型組與對(duì)照組在上肢運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能上無(wú)明顯差異。

一、疾病名稱

亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）

二、HD簡(jiǎn)介

臨床癥狀主要表現(xiàn)為舞蹈樣不自主動(dòng)作、精神障礙和進(jìn)行性癡呆，稱為“三聯(lián)征”。

病理表現(xiàn)主要為基底節(jié)區(qū)萎縮，其中以尾狀核最為明顯，殼核和蒼白球也有不同程度的萎縮。神經(jīng)元缺失主要見于基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)。

發(fā)病機(jī)制是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病。患者第四號(hào)染色體上的Huntington基因發(fā)生變異，產(chǎn)生了變異的mHTT，在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集，形成大的分子團(tuán)，在腦中積聚，影響神經(jīng)細(xì)胞的功能。

三、亨廷頓蛋白與HD

huntington基因處在第4號(hào)染色體的上部，亨廷頓病是由于huntington基因第1外顯子內(nèi)部不穩(wěn)定的CAG三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)展而發(fā)病，屬于三聯(lián)體重復(fù)序列疾病。等位基因CAG的重復(fù)數(shù)在正常人多在26次以下，HD患者則多超過(guò)40.5次，平均46.42次，可高達(dá)100次。

huntington蛋白在全身各個(gè)器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，其正常功能尚未完全明確，可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)吞和分泌及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。亨廷頓病患者h(yuǎn)untington基因的重復(fù)CAG序列可產(chǎn)生一段多聚谷氨酰胺鏈（polyglutamine，polyQ），連于HTT的末端，使HTT與其他蛋白結(jié)合形成不溶性復(fù)合物（核內(nèi)包涵體形成），并與其他蛋白相互作用，使神經(jīng)元內(nèi)蛋白錯(cuò)誤折疊，影響蛋白的進(jìn)展和降解過(guò)程，產(chǎn)生毒性功能。