該模型在研究輻射損傷及機體老齡化相關(guān)的損傷中具有廣泛的應(yīng)用價值。國內(nèi)已有相關(guān)單位咨詢引用。

在誘導(dǎo)模型過程中，照射設(shè)備具有自身屏蔽裝置，使用安全，不會對人體及環(huán)境造成任何影響。

1. 受照小鼠受照后外周血計數(shù)檢測

C57小鼠接受4Gy和6GyTBI，6m后全自動血液分析儀測定外周血，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、淋巴細(xì)胞百分比（LY%）下降，與假照射組小鼠有明顯差異。中性粒細(xì)胞百分比（NE%）（圖1）。

注：A.白細(xì)胞計數(shù)B.紅細(xì)胞計數(shù)C.血紅蛋白濃度D.血小板計數(shù)E.中性粒細(xì)胞百分比F.淋巴細(xì)胞百分比。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

圖1. 受照組小鼠與對照組小鼠外血計數(shù)比較

2.免疫臟器系數(shù)

與對照組小鼠相比，4Gy組和6Gy組小鼠胸腺系數(shù)降低，。其中6Gy組與對照組差異有顯著性（P＜0.05），脾臟系數(shù)略有增加，差異無顯著性，結(jié)果見圖2。

注：A.胸腺系數(shù)B.脾臟系數(shù)。*：P＜0.05。

圖2. 受照組小鼠與對照組小鼠臟器系數(shù)比較

3.外周血免疫分型

相對于對照組，4Gy組和6Gy組CD4+均有上升，從分別從12.49±1.16%上升到14.6±0.51%和16.48±2%，均具有顯著性差異（P＜0.05）。CD8a+細(xì)胞三個組別之間未見明顯變化。CD4/CD8比值分別為對照組：1.16±0.10，4Gy照射組1.28±0.17，6Gy照射組1.46±0.26，6Gy組CD4/CD8比值與對照組比較有明顯上升（P＜0.05）。B220+細(xì)胞從對照組62.89±2.33%降低到4Gy照射組55.63±3.61%和6Gy照射組54.2±3.54%，差異均具有極顯著性（P＜0.001）。NK1.1+細(xì)胞與B220+細(xì)胞變化趨勢一樣，分別從8.44±0.7%降低到6.81±1.58%和6.6±0.65%。上述三組4Gy和6Gy之間差異均無顯著性區(qū)別。單核細(xì)胞三個組別之間未見到明顯差異。結(jié)果見圖3。

注：A. CD4+ B. CD8+ C. B220+ D. NK1.1+ E. CD11b&F4/80+F. CD4+/CD8+。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

圖3. 老年小鼠與年輕小鼠外周血免疫細(xì)胞分型比較

4.脾臟免疫細(xì)胞分型

相較于對照組，照射組CD3+細(xì)胞有上升的趨勢，但無顯著性差異。B220細(xì)胞，照射組均有明顯下降，4Gy組和6Gy組相較于對照組有極顯著差異（P＜0.01），兩組之間未見明顯差異。見圖4。

注：A. CD3+ B. B220+。**：P＜0.01。

圖4.受照組小鼠與對照組小鼠脾臟免疫細(xì)胞分型比較

5.脾臟T細(xì)胞P16mRNA表達(dá)量檢測

結(jié)果顯示，與對照組相比，6Gy組有個別數(shù)據(jù)p16 mRNA明顯升高，采用卡方檢驗，未見顯著性差異。結(jié)果見圖5。

圖5.受照組小鼠與對照組小鼠脾臟T細(xì)胞的P16 mRNA表達(dá)比較

（一）實驗材料

1.實驗動物

10~12周齡的SPF級雄性健康C57BL/6J小鼠，體重22~24g，共24只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0004]。小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物房屏障環(huán)境[SYXK(津)2014－0002]。本實驗經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所IACUC的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為1402。并根據(jù)3R原則對實驗動物的使用和飼養(yǎng)給予人道關(guān)懷。

2.試劑與儀器

熒光標(biāo)記抗體NK1.1-FITC購于Biolegend公司；CD11b-APC，購于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7購于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC購于biolegend公司。EDTA-K3購于sigma公司。紅細(xì)胞裂解液購于Invitrogen公司。大鼠脾臟單個核細(xì)胞分離液試劑盒購于索萊寶公司。EasySep?Mouse T Cell Isolation Kit購于STEMCELL Technologies公司。全自動血液分析儀MEK-7222K（日本光電）；BD流式分析儀（BDFACSAria II cell sorter，BD Bioscience ）。銫源伽馬射線輻照儀（Gammacell-40，加拿大原子能有限公司）。

（二）實驗方法

1.小鼠分組和照射

小鼠均分為三組：對照組（假照射組），4Gy IR組（4Gy組），6Gy IR組（6Gy組）,照射劑量率為1Gy/min。小鼠于SPF級動物房中飼養(yǎng)，照射后每天觀察記錄體重變化。

2 小鼠外周血常規(guī)檢測

小鼠TBI后6m小鼠眼眶靜脈叢取血，抗凝管收集外周血，全自動血液分析儀測定外周血中白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指標(biāo)。

3 小鼠胸腺、脾臟指數(shù)測定

小鼠TBI 后6m稱重安樂死，取胸腺、脾臟并稱重，計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器(mg)/體重(g)。

4 外周血免疫細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞分型檢測

小鼠TBI后6m，將分離的小鼠脾臟研磨制備脾細(xì)胞懸液。分別取外周血和細(xì)胞懸液50μL，各加入1mL 1×紅細(xì)胞裂解液，室溫條件下裂解8min（期間混勻兩次），1500r/min離心5min，4℃。棄上清，保持每個樣本100μL體系，加入對應(yīng)的混合抗體，冰上避光孵育30min。2mL PBS洗一遍，離心條件不變。加入300μLPBS過濾到流式管中，上機檢測。

5 脾臟T細(xì)胞分離及P16mRNA表達(dá)量檢測

小鼠TBI后6 m，按索萊寶ficoll試劑盒和STEMCELLTechnologies的T細(xì)胞陰選試劑盒說明書方法進(jìn)行分離。將收集的細(xì)胞重懸計數(shù)，按每1~5×106個細(xì)胞加入1mL trizol保存，送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司檢測P16mRNA表達(dá)量。

6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPadPrism 6軟件(SanDiego，CA，USA)處理數(shù)據(jù)、作圖，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?± s）表示，組間差異采用ANOVA檢驗和卡方檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

一、疾病概述

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，核電設(shè)施使用增多，人類太空活動能力提升使輻射暴露的可能性不斷增加。另外臨床接受放射性治療癌癥患者也在不斷上升。造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)對電離輻射（Ionizing Radiation，IR）具有高度的敏感性。受照后不僅會引起急性骨髓抑制，對遠(yuǎn)期造血免疫功能也會有影響。受到亞致死劑量照射后會出現(xiàn)造血免疫系統(tǒng)急性損傷性變化。隨著時間延長機體各項免疫指標(biāo)逐步恢復(fù)，但也會出現(xiàn)一些持久性改變，從而影響機體的健康狀態(tài)。

二、模型背景

1、實驗動物背景信息

C57BL/6J小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

2、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。隨著核電站的建立，人類太空活動的增加，臨床上放射診療設(shè)備的廣泛應(yīng)用，以及核武器恐怖威脅等因素的存在，人類的輻射暴露性可能性日益增加。2001年美國國家輻射保護(hù)委員會指出，當(dāng)出現(xiàn)核事故，多數(shù)人可能受到1．10Gy齊J量的電離輻射(Ionizingradiation，IR)照射。輻射引起的重要臟器損傷會導(dǎo)致受照射人員死亡。其中，骨髓抑制(bonemarrow suppression)是一個主要的致死原因。骨髓抑制分為急性骨髓抑制(acutebone marrow suppression)和長期骨髓抑制(10ng—termbone marrow suppression)，急性骨髓抑制主要是電離輻射引起的造血祖細(xì)胞(hernatopoieticprogenitor cells，HPCs)和少量的造血干細(xì)胞(hematopoieticstem cells，HSCs)凋亡，以及誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞增殖障礙。臨床上，可以給予造血細(xì)胞因子(hemopoieticfactors，HGF)緩解癥狀。長期骨髓抑制是輻射遠(yuǎn)期損傷的主要表現(xiàn)，也是臨床進(jìn)行腫瘤放療、化療時最常見的毒副作用之一，直接影響到治療效果及患者的生存質(zhì)量。長期骨髓抑制不像急性期骨髓抑制，往往患者外周血象并無明顯異常，尤其給予細(xì)胞因子治療后，外周血白細(xì)胞有了較好的恢復(fù)；長期骨髓抑制具有遲發(fā)性，在臨床上容易被忽視，目前尚無有效治療手段。

從細(xì)胞層面，電離輻射可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞細(xì)胞的凋亡，損傷造血千細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，無法維持在靜止期，并且會損傷造血干細(xì)胞微環(huán)境的功能。

從分子層面，輻射誘導(dǎo)的DNA損傷，氧化應(yīng)激和端?？s短均是造血干細(xì)胞衰老的誘因。其中IR誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激或活性氧水平升高具有重要作用。電離輻射誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygen species，ROS)的表達(dá)。ROS主要包括超氧陰離子(02-)，羥自由基(HO-)，過氧化氫(H2O2)，單線態(tài)氧(1O2)，次氯酸(HOCI)等組成。ROS正常條件下可以調(diào)節(jié)多種生理活動，病理條件下，產(chǎn)生過量的ROS則會引起DNA損傷，基因組不穩(wěn)定性增加，隨著年齡的增加，ROS損傷產(chǎn)物的累積會引起細(xì)胞衰老以及衰老相關(guān)的疾病。細(xì)胞ROS主要由線粒體呼吸產(chǎn)生，近來研究結(jié)果顯示，由于造血干細(xì)胞大多數(shù)處于靜止期，線粒體含量與骨髓中其他細(xì)胞相比線粒體含量非常低，在造血干細(xì)胞中，主要是由NADPH氧化酶家族中(NADPHoxidases，NOXs)的NOX4產(chǎn)生的ROS來調(diào)控造血干細(xì)胞的功能。HSCs比分化的細(xì)胞對氧化應(yīng)激更敏感。

但是現(xiàn)有研究階段缺乏輻射引起長期的造血系統(tǒng)損傷數(shù)據(jù)。對長期造血系統(tǒng)損傷缺乏深入研究。有待進(jìn)一步研究長期造血系統(tǒng)損傷對整個機體及造血系統(tǒng)微環(huán)境的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 李程程，管博文，蘇路，等. 白消安對小鼠造血干細(xì)胞功能的損傷作用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2018,28(2):26-32.

[2] 鞏萍，孫銅，戴曉莉，等. 松花粉對環(huán)磷酰胺增效減毒作用研究[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2017,27(05):60-63.

[3] 陶祥，鄭芹，楊惠玲. S180荷瘤鼠免疫器官等變化及小柴胡湯對其影響的研究[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2004,25(12):1384-1385.

[4] 林帥，陳孟毅，劉冰，等. 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠免疫細(xì)胞損傷及修復(fù)作用的影響[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2016,13(36):8-13.

[5] 路璐，張俊伶，李德冠，等. 6Gy137Csγ射線照射對小鼠造血功能損傷的動態(tài)觀察研究[J]. 國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志, 2015,39(5):393-396.

[6] 李德冠，樊賽軍，孟愛民. 輻射導(dǎo)致長期骨髓抑制的研究進(jìn)展[J]. 國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志, 2015,39(4):324-327.

[7] 管博文，盧延華，蘇路路. 老年和青年C57BL/6J小鼠外周血及免疫細(xì)胞分型測定分析[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2019,29(7):00-00.

[8] Pang W W, Schrier S L, Weissman I L.Age-associated changes in human hematopoietic stem cells[J]. Semin Hematol,2017,54(1):39-42.

[9] 李德冠，王月英，路璐，等. 輻射對小鼠免疫系統(tǒng)損傷遠(yuǎn)期影響的研究[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2011,27(12):1362-1363.

[10] 李德冠，王月英，吳紅英，等. 大劑量γ射線照射對小鼠免疫系統(tǒng)損傷遠(yuǎn)期影響的研究[J]. 國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志, 2012,36(2):109-112.

[11] 李德冠，王月英，王小春，等. p38抑制劑對輻射損傷小鼠中免疫細(xì)胞的作用[J]. 天津醫(yī)藥, 2011,39(10):933-935.

[12] 崔玉芳，丁彥青，徐菡，等. 大劑量γ線照射對小鼠免疫功能近期、遠(yuǎn)期的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2004,20(06):675-677.

[13] 吳安慶，陳秋，劉偉，等. X射線全身照射對小鼠免疫系統(tǒng)的損傷效應(yīng)[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2013,33(03):193-196.

[14] He S, Sharpless N E. Senescence inHealth and Disease[J]. Cell, 2017,169(6):1000-1011.

[15] Wang Y, Liu L, Pazhanisamy S K, etal. Total body irradiation causes residual bone marrow injury by induction ofpersistent oxidative stress in murine hematopoietic stem cells.[J]. FreeRadical Biology & Medicine, 2010,48(2):348-356.

[16] Shao L, Wang Y, Chang J, et al.Hematopoietic stem cell senescence and cancer therapy-induced long-term bonemarrow injury.[J]. Translational Cancer Research, 2013,2(5):397.

[17] Wood W A, Krishnamurthy J, Mitin N,et al. Chemotherapy and Stem Cell Transplantation Increase p16INK4a Expression,a Biomarker of T-cell Aging[J]. EbioMedicine, 2016,11:227-238.