國際上此前雖然有過PON1基因敲除小鼠的研究報道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激和動脈粥樣硬化疾病相關(guān)的研究[19]，沒有敲除大鼠以及免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)報道。目前，僅有我們首次報道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有關(guān)免疫T細(xì)胞發(fā)育受損的研究，以及關(guān)于PON1基因敲除大鼠腦部小膠質(zhì)細(xì)胞異常活化的最新的研究成果[20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用該動物模型開展的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥表型研究和分子機(jī)制研究，為免疫學(xué)和神經(jīng)炎癥研究提供了工具動物模型支撐。大鼠資源詳見（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

模型制作及動物實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18002和ZLF18003。本實驗部分使用了基因修飾動物（基因敲除），如果動物逃逸，將會造成的環(huán)境潛在的基因污染。實驗動物飼養(yǎng)繁殖于三樓動物房屏障環(huán)境中，整個實驗過程中保證動物處于監(jiān)管狀態(tài)，無逃脫可能。動物房出入口安放擋鼠板，嚴(yán)防動物逃逸，定期對門窗進(jìn)行檢查，保證嚴(yán)密，動物籠具一經(jīng)發(fā)現(xiàn)破損，立即更換，飼養(yǎng)人員出入確保動物房門關(guān)緊并鎖住等。含重組DNA的廢棄核酸樣品、離心管、槍頭等用1M NaOH溶液浸泡后，裝入密封袋中，統(tǒng)一送到化學(xué)廢棄物處理公司處理。

1.PON1基因敲除大鼠的蛋白表達(dá)鑒定。

1.1 PON1蛋白在基因敲除大鼠的腦組織和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)缺失。

圖2 PON1在腦和小膠質(zhì)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平鑒定

1.2 PON1蛋白在基因敲除大鼠的胸腺組織表達(dá)缺失。

圖3 PON1在脾和胸腺免疫器官中的蛋白表達(dá)水平鑒定

1.3 PON1敲除降低LPS誘導(dǎo)致死率。

圖4 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS實驗中的生存率分析

1.4 PON1 敲除降低LPS誘導(dǎo)后血清中的TNF-α水平。

圖5 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS實驗血清的ELISA分析

圖6 PON1敲除大鼠和野生型大鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化分析

1.6 PON1 基因敲除可使小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抑炎、促吞噬的表型。

1.6.1 PON1敲除大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)

圖7 PON1對小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié)

1.6.2 PON1 敲除降低LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子分泌

圖8 利用Luminex 和ELISA方法檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的分泌水平。

1.6.3 PON1敲除導(dǎo)致胸腺變小，胸腺細(xì)胞減少

圖9 PON1敲除大鼠和野生型大鼠胸腺細(xì)胞對比分析

1. 實驗材料

1.1實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司和北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2主要實驗儀器

Nikon顯微注射儀

Nikon光學(xué)顯微鏡

BIO-RAD電泳儀

Tanon電泳槽

Tanon數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)

Incucell恒溫培養(yǎng)箱溫控

TAITEC振蕩箱

Eppendorf離心機(jī)

Eppendorf移液器

2.實驗操作規(guī)程和動物處理倫理

模型制作中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003，簡要步驟如下：

2.1 供卵雌鼠超排

實驗第一天8：00腹腔注射PMSG30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，實驗第三天10：00腹腔注射HCG30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即與與種鼠1：1合籠。實驗第四天8：00～9：00檢查陰道栓，有陰道栓的大鼠在大鼠標(biāo)牌上注明日期和⊕（陽性），撿出有陰栓的大鼠進(jìn)行受精卵的收集。

2.2 受精卵的收集

2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脫頸處死，解剖大鼠，找到卵巢，輸卵管和子宮，將卵取出，用透明質(zhì)酸酶消除胚泡的黏著，使卵分離。在移換到另外的培養(yǎng)液中，要將透明質(zhì)酸酶充分洗凈（洗約3~5次）。

2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液

2.4. 僅將未損壞的完成操作的卵收集起來，移植到假妊娠大鼠輸卵管中。術(shù)后將大鼠置于安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。

2.5 基因表型鑒定

在判定有導(dǎo)入基因大鼠之后，立即將基因修飾大鼠另行飼養(yǎng)，對不用的大鼠進(jìn)行處理。陰性大鼠的處理：（1）留和陽性大鼠等量的陰性大鼠對照。（2）剩余的陰性大鼠用于其它符合動物倫理的其他實驗室的實驗（保存記錄）。

3. PON1基因敲除靶點設(shè)計與測序鑒定

利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶點位于第四外顯子。通過顯微注射成功獲得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小為342bp，能夠穩(wěn)定傳代。PON1 雜合子大鼠之間雜交得到同窩陰性對照大鼠和敲除純合子用于實驗研究。大鼠模型資源詳見（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

圖1 PON1基因敲除設(shè)計策略

一、疾病概述

我們的模型研究結(jié)果證實PON1敲除損傷免疫T細(xì)胞的發(fā)育，并顯著調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，之前的文獻(xiàn)報道揭示了PON1參與抑制單核-巨噬細(xì)胞的分化，均提示PON1可作為一種新的免疫調(diào)節(jié)因子。該動物模型涉及到小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞發(fā)育兩方面，分述如下：

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)常駐的免疫細(xì)胞，數(shù)量約占人腦細(xì)胞總數(shù)的0.5-16.6%，又稱腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞，構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線。生理狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞處于相對的靜息狀態(tài)，因此被稱為靜息型小膠質(zhì)細(xì)胞(resting microglia)。靜息型小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中起著調(diào)控神經(jīng)元存活和修飾突觸的作用，并且在成熟的健康腦中具有探測和調(diào)控神經(jīng)元活動的功能；在炎癥刺激病理狀態(tài)下，包括在腦損傷、病原入侵以及退行性疾病中，小膠質(zhì)細(xì)胞首先啟動，遷移至損傷部位，轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，呈現(xiàn)阿米巴蟲樣的典型巨噬細(xì)胞形態(tài)，因此被稱為阿米巴樣小膠質(zhì)細(xì)胞(amoebic microglia)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活大體分為M1經(jīng)典激活型和M2選擇激活型。M1型為促炎狀態(tài)，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6或白介素12，這些炎性因子會對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用, 嚴(yán)重的會致使神經(jīng)細(xì)胞凋亡；M2型為抗炎狀態(tài)，能夠釋放抗炎性細(xì)胞因子如白介素4、白介素13，吞噬損傷的神經(jīng)細(xì)胞碎片、促進(jìn)組織修復(fù)和神經(jīng)元的再生。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是許多神經(jīng)退行性病變的重要病理基礎(chǔ)，在神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷后的神經(jīng)退變中也發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬作用清除細(xì)胞碎片，并釋放神經(jīng)生長及抗炎因子而減輕神經(jīng)損傷，促進(jìn)組織修復(fù)。然而很明顯，小膠質(zhì)細(xì)胞高度活化狀態(tài)可釋放高水平的促炎因子及細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而造成神經(jīng)元失能及細(xì)胞死亡。神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及浸潤的巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性。

胸腺是機(jī)體的重要免疫器官，由皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分組成，主要包括胸腺上皮細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是淋巴細(xì)胞的一種,在免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育經(jīng)歷CD4-CD8-(Double negative,DN)、CD4+CD8+(Double positive,DP)及CD4+或CD8+(Singlepositive,SP)三個主要階段,最后進(jìn)入外周淋巴組織。胸腺病變將對機(jī)體免疫功能帶來嚴(yán)重影響，使機(jī)體免疫自穩(wěn)功能紊亂并伴發(fā)自身免疫性疾病。但是，目前對于胸腺發(fā)育和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的分子機(jī)制仍不清楚。

二、模型背景

1、PON1信息

人類的對氧磷酶家族包括3個成員即PON1、PON2 和PON3，其中PON1是由354 個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為43000～47000的糖蛋白。目前的研究表明，PON1 主要由肝臟合成，大部分結(jié)合在肝臟細(xì)胞內(nèi)微粒體上，在人體廣泛分布于肝臟、血液、腎臟、脾臟、腸及腦，其中在肝臟和血液中活力最高。PON1 在血液中借助于疏水的N 端和載脂蛋白AI 緊密結(jié)合，固定于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)顆粒上。PON1 因能水解對氧磷而命名為對氧磷酶，實際上PON1 是一個可以水解多種內(nèi)源或外源物質(zhì)的、多功能的水解酶，其底物可歸為芳香類和內(nèi)脂類二類。PON1 參與脂代謝、藥物代謝和毒物代謝等多種病理和生理過程。與心腦血管病，糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病有關(guān)。

2、實驗動物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。

3.1該動物模型的研究目的及意義

對氧磷酶1（paraoxonase 1, PON1）是AD 的風(fēng)險基因，PON1 與AD 的關(guān)系目前停留在流行病調(diào)研水平，機(jī)制研究尚未見報道。PON1 是否也通過抗氧化或抗炎癥作用抵抗AD 的發(fā)生發(fā)展，機(jī)制如何，仍有待開展更多研究工作加以論證。PON1基因敲除大鼠可以用于研究PON1功能缺失對于免疫功能的影響。

更深入地講，小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用是阿爾茨海默病中Aβ清除的主要途徑之一。TREM2已經(jīng)成為近五年國內(nèi)外AD 研究前沿?zé)狳c和潛在治療靶點之一。TREM2 可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞由M1 型（神經(jīng)損傷）向M2 型（神經(jīng)保護(hù)）轉(zhuǎn)變，是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的重要信號蛋白[1]。最新證據(jù)顯示，在小鼠模型中TREM2 除了能減少與AD 相關(guān)的病理，還能夠緩解認(rèn)知功能上的缺陷[2, 3]。這提示使用大腦現(xiàn)有的免疫機(jī)制來清除淀粉樣蛋白可以作為一種治療AD 的新策略，可通過上調(diào)TREM2 的表達(dá)或激活TREM2 信號通路實現(xiàn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)PON1與TREM2之間存在互作關(guān)系，我們利用PON1基因敲除大鼠，展開研究將深化對這一腦內(nèi)免疫機(jī)制的理解。

3.2 國內(nèi)外研究進(jìn)展

在過去20年，PON1的研究主要集中在心腦血管病方面，一是PON1多態(tài)性與粥樣硬化、冠心病、腦梗死等的相關(guān)性[4, 5]；二是PON1 在血漿中的水平作為心腦血管病預(yù)警標(biāo)志物研究。在PON1 分子機(jī)制方面反而沒有大的進(jìn)展，僅僅報道了PON1在脂代謝和血管疾病中的可能發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[6-10]。

迄今，PON1 與AD 等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系目前停留在流行病調(diào)研水平，研究認(rèn)為PON1的多態(tài)性是AD或PD的危險因子或某些多態(tài)性攜帶者對環(huán)境致病因素更敏感[11-16]，血漿中的PON1 低活性也是AD 的危險因素[17, 18]，因此PON1是AD和PD的風(fēng)險基因，然而，PON1參與AD的分子機(jī)制研究尚未見報道。

國際上此前雖然有過PON1基因敲除小鼠的研究報道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激和動脈粥樣硬化疾病相關(guān)的研究[19]，沒有PON1基因敲除大鼠及調(diào)節(jié)免疫的相關(guān)報道。目前，僅有我們首次報道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有關(guān)免疫T細(xì)胞發(fā)育受損的研究，以及關(guān)于PON1基因敲除大鼠腦部小膠質(zhì)細(xì)胞異常活化的最新的研究成果[20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用該動物模型開展的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥表型研究和分子機(jī)制研究，為AD和神經(jīng)系統(tǒng)研究提供了工具動物模型支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhai, Q., et al., Triggering Receptor Expressed on MyeloidCells 2, a Novel Regulator of Immunocyte Phenotypes, Confers Neuroprotection byRelieving Neuroinflammation. Anesthesiology, 2017. 127(1): p.98-110.

[2] Zhao, Y., et al., TREM2 Is a Receptor for beta-Amyloid thatMediates Microglial Function. Neuron, 2018. 97(5): p. 1023-1031e7.

[3] Lee, C.Y.D., et al., Elevated TREM2 Gene Dosage ReprogramsMicroglia Responsivity and Ameliorates Pathological Phenotypes in Alzheimer'sDisease Models. Neuron, 2018. 97(5): p.1032-1048 e5.

[4] Kowalska, K., E. Socha, and H. Milnerowicz, Review: The role of paraoxonase incardiovascular diseases. Ann Clin Lab Sci, 2015. 45(2): p.226-33.

[5] Mackness, M. and B.Mackness, Human paraoxonase-1 (PON1):Gene structure and expression, promiscuous activities and multiplephysiological roles. Gene, 2015. 567(1): p. 12-21.

[6] Aviram, M. and J.Vaya, Paraoxonase 1 activities,regulation, and interactions with atherosclerotic lesion. Curr OpinLipidol, 2013. 24(4): p. 339-44.

[7] Mackness, M. and B. Mackness, Targeting paraoxonase-1 in atherosclerosis. Expert Opin Ther Targets,2013. 17(7): p. 829-37.

[8] Eren, E., N. Yilmaz,and O. Aydin, Functionally defectivehigh-density lipoprotein and paraoxonase: a couple for endothelial dysfunctionin atherosclerosis. Cholesterol, 2013. 2013: p. 792090.

[9] Mineo, C. and P.W. Shaul, PON-dering differences in HDL function in coronary artery disease. JClin Invest, 2011. 121(7): p. 2545-8.

[10] Perla-Kajan, J. and H. Jakubowski, Paraoxonase 1 and homocysteine metabolism. AminoAcids, 2012. 43(4): p. 1405-17.

[11]Bednarska-Makaruk,M.E., et al., Paraoxonase 1 (PON1)gene-108C>T and p.Q192R polymorphisms and arylesterase activity of theenzyme in patients with dementia. Folia Neuropathol, 2013. 51(2): p.111-9.

[12] Cagnin, A., et al., LDL density and oxidation aremodulated by PON1 promoter genotype in patients with Alzheimer's disease. JAlzheimers Dis, 2013. 34(2): p. 377-85.

[13] He, X.M., et al., Gln192Arg polymorphism in paraoxonase 1gene is associated with Alzheimer disease in a Chinese Han ethnic population.Chin Med J (Engl), 2006. 119(14): p. 1204-9.

[14] Akhmedova, S.N., A.K. Yakimovsky, and E.I. Schwartz,Paraoxonase 1 Met--Leu 54 polymorphism is associated with Parkinson's disease.J Neurol Sci, 2001. 184(2): p. 179-82.

[15] Manthripragada, A.D., et al., Paraoxonase 1, agriculturalorganophosphate exposure, and Parkinson disease. Epidemiology, 2010. 21(1): p.87-94.

[16] Atasoy, H., et al., Paraoxonase1 192 (PON1 192) genepolymorphism and serum paraoxonase activity in panic disorder patients. InVivo, 2015. 29(1): p. 51-4.

[17] Erlich, P.M., et al., Serum paraoxonase activity isassociated with variants in the PON gene cluster and risk of Alzheimer disease.Neurobiol Aging, 2012. 33(5): p. 1015 e7-23.

[18] Bednarska-Makaruk, M., et al., Positive correlation ofparaoxonase 1 (PON1) activity with serum insulin level and HOMA-IR in dementia.A possible advantageous role of PON1 in dementia development. J Neurol Sci,2013. 324(1-2): p. 172-5.

[19] Rozenberg O , Rosenblat M , Coleman R , et al.Paraoxonase (PON1) deficiency is associated with increased macrophage oxidativestress: studies in PON1-knockout mice[J]. Free Radical Biology & Medicine,2003, 34(6):774-784.

[20] Lin Bai, Guiying Shi, Yuanwu Ma, Li Zhang,Feifei Guan, XuZhang, Yanfeng Xu, Houzao Chen & Lianfeng Zhang. Paraoxonase1 knockout ratshave impaired T cell development at the CD4/CD8 double-negative todouble-positive transition stage. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 14457.