母子分離加早期離乳，雄性大鼠顯示焦慮行為，而雌性大鼠未顯示焦慮行為。在非應(yīng)激狀態(tài)下（ Y迷宮實(shí)驗(yàn)），雌性大鼠空間工作記憶能力下降。在應(yīng)激狀態(tài)下（Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)），雌性和雄性大鼠的空間參考記憶能力均未受損。條件恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄性大鼠環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶能力增強(qiáng)。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄性大鼠前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性下降，可能是其焦慮行為的產(chǎn)生機(jī)制之一。母子分離加早期離乳對(duì)成年大鼠影響的性別差異，還需要進(jìn)一步研究。

該研究在已報(bào)導(dǎo)的小鼠母子分離加早期離乳應(yīng)激方法基礎(chǔ)上，首次制備了大鼠母子分離加早期離乳應(yīng)激模型，注重了應(yīng)激因素的累計(jì)效應(yīng)，更接近臨床。本模型對(duì)于揭示早期生活應(yīng)激事件和成年后神經(jīng)精神障礙的關(guān)系及分子機(jī)制研究具有一定意義。本模型的其他病理生理機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

本模型不涉及除遺傳物質(zhì)重組對(duì)環(huán)境生態(tài)影響以外的其它安全性問(wèn)題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會(huì)的要求執(zhí)行，可以確保不產(chǎn)生安全性問(wèn)題。

1.MSEW雄性大鼠出現(xiàn)焦慮行為。空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)大小鼠焦慮行為的實(shí)驗(yàn)方法。空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)中，動(dòng)物在中央?yún)^(qū)時(shí)間減少或高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物在開(kāi)臂時(shí)間和中央?yún)^(qū)時(shí)間減少，閉臂時(shí)間增多，均提示動(dòng)物焦慮行為增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），雄性大鼠MSEW模型中央?yún)^(qū)時(shí)間減少。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖2），雄性大鼠MSEW模型開(kāi)臂百分比，向下探頭次數(shù)均減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示雄性大鼠MSEW模型，而雌性大鼠無(wú)上述表現(xiàn)。

圖1 MSEW大鼠模型空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)中央?yún)^(qū)時(shí)間（A）及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)開(kāi)臂時(shí)間百分率（OT%）向下探頭次數(shù)（B）、中央?yún)^(qū)時(shí)間（C）及在閉臂中的時(shí)間（D）

2.MSEW雌雄性大鼠聯(lián)想學(xué)習(xí)無(wú)損傷，但MSEW雄性大鼠環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶增強(qiáng)。條件性恐懼實(shí)驗(yàn)是由一個(gè)條件刺激（聲音、光照）與一個(gè)引起強(qiáng)烈恐懼反應(yīng)的非條件刺激（足底電擊）結(jié)合而成，當(dāng)條件刺激與非條件刺激產(chǎn)生聯(lián)想，生成條件性恐懼記憶，動(dòng)物表現(xiàn)為僵直時(shí)間增長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物在條件恐懼訓(xùn)練箱中適應(yīng)3 min，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的訓(xùn)練，每輪訓(xùn)練包括：接受聲音刺激（30s，5000HZ，70dB），聲音刺激的最后1 s給予電流刺激（0.65 mA ,1s）。每輪訓(xùn)練間隔30 s。24 h后，將動(dòng)物放入同一訓(xùn)練箱。無(wú)聲音刺激，無(wú)電擊，記錄5 min 內(nèi)的木僵行為（freezing ），檢測(cè)環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼記憶。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，訓(xùn)練階段，MSEW雌雄性大鼠聯(lián)想學(xué)習(xí)無(wú)損傷。環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼記憶測(cè)試中，MSEW雄性大鼠恐懼記憶增強(qiáng)。

圖2MSEW大鼠模型條件性恐懼訓(xùn)練階段不動(dòng)時(shí)間（A）及環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間（D）

3. MSEW雌性大鼠顯示空間工作記憶能力輕微下降。Y迷宮空間識(shí)別實(shí)驗(yàn)可用于空間工作記憶測(cè)試。訓(xùn)練期，關(guān)閉一個(gè)臂，讓大鼠在其他兩個(gè)臂自由探索5min. 15min間隔后進(jìn)入測(cè)試期，打開(kāi)之前關(guān)閉的臂（新臂），大鼠在三個(gè)臂自由活動(dòng)5min，記錄大鼠在各個(gè)臂探索的時(shí)間和路程，空間工作記憶損害的動(dòng)物在新臂中探索的時(shí)間和路程會(huì)縮短。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌性大鼠在測(cè)試期第一分鐘內(nèi)探索新臂時(shí)間雖增多，但與其他臂比較，無(wú)顯著性差異。雄性大鼠探索新臂時(shí)間增多，與其他臂比較，有顯著性差異。

圖3雌雄MSEW大鼠模型在Y迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試期第一分鐘內(nèi)探索各臂時(shí)間的時(shí)間（A,B）

4. MSEW雌雄大鼠空間參考記憶無(wú)損傷。Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)動(dòng)物的空間參考記憶能力。Barnes迷宮尺寸為直徑120cm的白色啞光圓盤(pán)，上有12個(gè)直徑10cm圓洞，等距分布在圓盤(pán)邊緣，逃避盒固定在某一目標(biāo)洞下。實(shí)驗(yàn)時(shí)伴有強(qiáng)光（白熾燈，250 lux）和噪音刺激（吹風(fēng)機(jī)，80 db）。在Barnes圓盤(pán)周?chē)胖脠A形、方形等空間參照物。適應(yīng)階段：將實(shí)驗(yàn)鼠放于逃避盒中適應(yīng)2 min。訓(xùn)練階段：將動(dòng)物放于巴恩斯迷宮平臺(tái)中央的起始盒中，5ｓ后移走起始盒，打開(kāi)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上的光源和吹風(fēng)機(jī)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以隨機(jī)方向開(kāi)始探索迷宮，若動(dòng)物成功進(jìn)入躲避盒，關(guān)掉吹風(fēng)機(jī)，使其躲避盒中適應(yīng)30 s（蓋上蓋子），若實(shí)驗(yàn)鼠在4 ｍｉｎ內(nèi)未進(jìn)入躲避盒，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)進(jìn)入，并令其在躲避盒中適應(yīng)30 s。每次實(shí)驗(yàn)間隔用７５％酒精擦拭迷宮表面和躲避盒并轉(zhuǎn)動(dòng)迷宮，消除上次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)鼠遺留的氣味和排泄物線索，確保實(shí)驗(yàn)鼠通過(guò)自身空間記憶線索找到目標(biāo)洞。目標(biāo)洞始終固定于同一方位，每天訓(xùn)練3次，每次4 min，訓(xùn)練2d。從第二次訓(xùn)練開(kāi)始，每次訓(xùn)練之前將迷宮隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)一至數(shù)個(gè)洞的位置，但目標(biāo)箱始終固定在同一方位。空間探索階段：訓(xùn)練結(jié)束后24 h，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。移除目標(biāo)洞，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由探索迷宮90s，測(cè)試其空間記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌雄大鼠MSEW模型對(duì)Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期和探索期尋洞潛伏期與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異。

圖4雌雄MSEW大鼠模型在Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期（A,B）尋洞潛伏期及探索期尋洞潛伏期及在目標(biāo)洞周?chē)臅r(shí)間（C,D）

5. MSEW 雌雄大鼠前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元電生理變化。MSEW 雌雄大鼠前額皮層神經(jīng)元的閾值和幅度沒(méi)有影響。在400和500pA刺激下，MSEW雄性大鼠谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粩?shù)目減少，提示神經(jīng)元興奮性下降。

圖5雌雄MSEW大鼠模型前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元閾值和幅度（A,B）及400和500pA刺激下，產(chǎn)生的動(dòng)作電位數(shù)目（C,D）

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SD孕鼠。實(shí)驗(yàn)分為雌性對(duì)照，雌性MSEW組，雄性對(duì)照，雄性MSEW組。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)箱、條件性恐懼測(cè)試分析系統(tǒng)

3. 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：

大鼠幼崽出生第二天至第五天(postnatal day，PND2-5天)，從母鼠家籠移出，放置在另外房間的母子分離實(shí)驗(yàn)箱，4h/d, 實(shí)驗(yàn)箱分隔成開(kāi)放獨(dú)立的小隔間，每個(gè)隔間內(nèi)放置一只幼崽。實(shí)驗(yàn)箱放在加熱墊上，溫度維持在32℃左右。PND 6-16天, 母子分離8 h/d，母子分離實(shí)驗(yàn)在光照期進(jìn)行，固定在8:00-18:00時(shí)間段。PND17天,大鼠幼崽離乳，雌雄分籠。正常對(duì)照組幼崽始終在母鼠家籠，至PND 21天離乳，正常換水，換料，其余不予干擾。PND 6O天，進(jìn)行空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)及Barnes 迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組取3只動(dòng)物，麻醉，取腦，進(jìn)行前額皮層神經(jīng)電生理檢測(cè)。

生命早期（胚胎、新生兒、幼年）是機(jī)體腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)應(yīng)激的敏感性極高。該時(shí)期的應(yīng)激因素（如喪親、長(zhǎng)期與父母分離以及兒童期受虐或忽視），可破壞腦的結(jié)構(gòu)和功能的形成，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期甚至是終生的影響，其中對(duì)情緒和認(rèn)知功能的影響最大，是青少年及成年神經(jīng)精神疾患的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一。

大鼠對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)更為敏感，本研究建立了大鼠母子分離加早期離乳（Maternal separation with early weaning, MSEW）應(yīng)激模型，用于模擬生命早期應(yīng)激事件。這種雙重應(yīng)激模型更好的模擬了人類(lèi)累計(jì)的應(yīng)激效應(yīng)（“cumulative”stress）導(dǎo)致青少年和（或）成年發(fā)生神經(jīng)精神疾患的現(xiàn)象。本研究觀察了MSEW模型雌雄大鼠成年的行為學(xué)表型和神經(jīng)電生理變化。