CTLA4人源化小鼠模型
討論與結(jié)論
抗體療法是很受關(guān)注的免疫療法之一，在研究治療性抗體的效果時(shí)，可以使用免疫系統(tǒng)人源化小鼠進(jìn)行研究。如使用免疫缺陷小鼠進(jìn)行人外周血重構(gòu)，從而在小鼠中建立功能正常的人免疫系統(tǒng)。雖然這種模型可以用于篩選抗體的潛在抗癌作用，但在評(píng)估其它臨床參數(shù)，如自身免疫性方面受到一定限制。并且免疫系統(tǒng)人源化小鼠容易產(chǎn)生移植物抗宿主病，或需要人細(xì)胞因子刺激使移植后的細(xì)胞存活增殖。相比之下，CTLA4基因人源化小鼠的免疫應(yīng)答是在自然環(huán)境中產(chǎn)生的。并且，CTLA4基因人源化小鼠模型可以用于評(píng)估與潛在人類治療性抗體相關(guān)的自身免疫副作用的能力。
因此，本研究建立的CTLA4人源化小鼠模型改善了CTLA4在人與小鼠中種屬差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異，從而使藥物評(píng)價(jià)的結(jié)果更加客觀，為治療性抗體的驗(yàn)證提供了更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
生物安全性
模型制作及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為BL18003。本實(shí)驗(yàn)部分使用了基因修飾動(dòng)物（基因敲入），只在規(guī)定的SPF級(jí)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過(guò)程有防逃逸的措施，如擋鼠板等。動(dòng)物在離開(kāi)動(dòng)物設(shè)施后，進(jìn)行完相關(guān)試驗(yàn)后，立即進(jìn)行處死，取材。動(dòng)物尸體暫存于-20℃冰箱中，經(jīng)有資質(zhì)的公司運(yùn)走統(tǒng)一處理。
評(píng)價(jià)驗(yàn)證
4.1CTLA4人源化小鼠模型的建立
將F0代小鼠與C57小鼠進(jìn)行雜交，獲得雜合子hCTLA4 h/m,將雜合子互交并將子代進(jìn)行基因型鑒定（圖2），得到純合敲入小鼠hCTLA4 h/h。
圖2 PCR鑒定子代小鼠基因型
注：使用PCR鑒定子代小鼠基因型，突變可傳代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。h/h：CTLA4人源化純合子小鼠；h/m：ctla4人源化雜合子小鼠；m/m：野生型小鼠。
4.2CTLA4人源化小鼠組織中蛋白及mRNA表達(dá)
為了鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠是否在蛋白水平發(fā)生CTLA4人源化，取1-2月齡小鼠脾、肺進(jìn)行Western Blot，分別使用種屬反應(yīng)性為小鼠、大鼠和人，以及種屬反應(yīng)性為人的CTLA4抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)（圖3a）。結(jié)果顯示，市售的種屬反應(yīng)性為人的CTLA4抗體無(wú)法區(qū)分人源與鼠源的蛋白。
因?yàn)槭惺鄣鞍卓贵w無(wú)法區(qū)分人源與小鼠源CTLA4蛋白，使用RT-PCR鑒定人源化小鼠脾細(xì)胞（CD3抗體刺激4天）中mRNA表達(dá)（圖3b）。結(jié)果可見(jiàn)人特異性引物（hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT，hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC）只能擴(kuò)增純合子hCTLA4 h/h的cDNA，而小鼠特異性引物（mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。）也只能擴(kuò)增hCTLA4 m/m的cDNA，可見(jiàn)ctla4人源化轉(zhuǎn)基因小鼠中只表達(dá)人源CTLA4的mRNA。
圖3CTLA4在人源化小鼠中的蛋白及mRNA表達(dá)
注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化純合子小鼠。a：Western Blot 檢測(cè)CTLA4蛋白在脾和肺中的表達(dá)，CTLA4：種屬反應(yīng)性為小鼠、大鼠和人的CTLA4抗體，；hCTLA4：種屬反應(yīng)性為人的CTLA4抗體。b：RT-PCR檢測(cè)CTLA4mRNA在脾中的表達(dá)，
4.3人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因
文獻(xiàn)報(bào)道，CTLA4基因敲除小鼠會(huì)由于嚴(yán)重的自身免疫疾病，在出生后3-4周內(nèi)死亡。但在CTLA4人源化小鼠中，沒(méi)有觀察等到淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖4g-l），并且根據(jù)我們的觀察結(jié)果表明，純合的CTLA4人源化小鼠壽命正常，在10個(gè)月內(nèi)沒(méi)有觀察到自身免疫性疾病發(fā)展的跡象。因此，在純合的CTLA4人源化小鼠中，人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。
圖4各組織HE染色
注：hCTLA4m/m（a-f）及hCTLA4h/h（g-l）小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺中無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。圖中顯示的是心臟（a，g）、肝（b，h）、脾（c，i）、肺（d，j）、腎（e，k）、胸腺（f，l）的組織切片HE染色。比例尺=100μm。
4.4人源化CTLA4基因小鼠免疫系統(tǒng)正常。
我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了野生型小鼠和人源化CTLA4基因小鼠外周血中各類細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)其外周血中B細(xì)胞（B220+）、T細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8+）、粒細(xì)胞（CD11b）和NK細(xì)胞的比例都沒(méi)有明顯差異。同時(shí)檢測(cè)骨髓、脾臟和胸腺等免疫器官中免疫細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn)人源化CTLA4基因的小鼠和野生小鼠相比沒(méi)有差異。結(jié)果說(shuō)明人源化CTLA4基因后沒(méi)有改變正常生理狀態(tài)下小鼠免疫系統(tǒng)的組成（圖5）。
圖5CTLA4在人源化小鼠外周血中不同免疫細(xì)胞的比例
注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化純合子小鼠。a：流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)不同免疫細(xì)胞在外周血中的比例。B-E：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同免疫細(xì)胞的直方圖。
制備方法
3.1.4 模型構(gòu)建流程
利用CRISPR /Cas9技術(shù)，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot的方法進(jìn)行鑒定及分析。
3.1.5CTLA4人源化小鼠的建立
3.1.5.1CTLA4人源化小鼠模型的建立
（1）設(shè)計(jì)方案
一、載體構(gòu)建
1.sgRNA載體
載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector
Addgene ID:51132
根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)，合成sgRNA（上海英濰捷基）
targeting site 1:
gggttcaaacacatctcaagg
m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca
m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
targeting site2:
gagacttctggaacatggaGg
m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg
m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
合成的sgRNA單鏈通過(guò)退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSAⅠ線性化的載體
sgRNA插入位點(diǎn)示意圖
圖1CTLA4人源化小鼠模型構(gòu)建設(shè)計(jì)方案
構(gòu)建完成的sgRNA載體通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。（體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒：Ambion Am1354）
2，CAS9載體
載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
Addgene ID: 44758
載體通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒：Ambion Am1345）
顯微注射：
1、超數(shù)排卵：15只3-4周齡c57雌鼠注射激素進(jìn)行超排。
2、受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。
3、雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的c57雄鼠。
4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結(jié)扎的ICR雄鼠交配后選取見(jiàn)栓的雌鼠。
5、胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，4只受體鼠）。
基因型鑒定：
1、剪尾編號(hào)：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號(hào)及取材。
2、基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA
3、PCR檢測(cè)：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物（上海英濰捷基）
M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG
M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC
KO：
TM=62℃WT：727bp ko:(見(jiàn)測(cè)序分析)
PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序（TaKaRa RR042A）
反應(yīng)體系：
l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)
l2.0μl
ldNTP Mixture(2.5μM)
l1.6μl
l引物-S（50μM）
l0.2μl
l引物-A（50μM）
l0.2μl
l模板DNA
l2.0μl
lLA Taq
l0.2μl
l補(bǔ)加ddH2O至總體積
l20.0μl
擴(kuò)增程序：
l95℃
l15 min；
l95℃, 30 s
lTM-2℃, 30 s
l72℃, 2 min 30循環(huán)；
l72℃
lmin；
6×loading buffer終止反應(yīng)。
用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。
4、結(jié)果分析： 選取PCR檢測(cè)分子量不同于野生型條帶的(下圖中箭頭所示)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測(cè)序。
1-23#基因組PCR結(jié)果圖（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR結(jié)果）
1-23#基因組PCR結(jié)果圖（TaKaRa marker DL2000）（下游PCR結(jié)果）
5、測(cè)序結(jié)果：
KI：3#，5#，9#，14#，23#
黃色綠色為檢測(cè)引物，藍(lán)色字體為同源序列，紅色為H-CTLA4基因ORF，灰色為BGH poly A
ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa
3.1.5.2動(dòng)物繁殖和表達(dá)圖譜分析
獲得F0代后，首先通過(guò)與野生型C57小鼠進(jìn)行雜交，進(jìn)行基因修飾小鼠傳代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通過(guò)雜合子與雜合子雜交，獲得CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定
在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，并剪尾至1.5 mL EP管。然后參照鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說(shuō)明書(shū)按以下程序操作。
1.1.按小鼠數(shù)量配制組織消化液，試劑比例如下：
（單樣本）
Protease Plus
2 μL
Buffer L
100 μL
組織消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，充分混勻后使用。
1.2.向每個(gè)含有樣本的EP管中加入100 μL新鮮組織消化液，55℃水浴/金屬浴中消化15 min。組織消化時(shí)，務(wù)必將組織完全浸沒(méi)于消化液中。消化完成后，組織外觀上仍然完整，但足量的基因組DNA已經(jīng)釋放，不影響后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)。
1.3.將樣本置于95℃水浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清或連同組織的消化液可于-20℃保存三個(gè)月。
2. PCR擴(kuò)增2.1. PCR反應(yīng)體系：
PCR反應(yīng)組分
20 μL反應(yīng)體系(μL)
50 μL反應(yīng)體系(μL)
ddH2O
8
21
正向引物(10 μM)
0.5
1
反向引物(10 μM)
0.5
1
模板（消化產(chǎn)物）
1
2
2 x M-PCR OPTI? Mix
10
25
注：模板體積可以適當(dāng)調(diào)整。
2.2. PCR反應(yīng)條件：
溫度(℃)
時(shí)間
循環(huán)數(shù)
94
5 min
1
94
20 sec
35
60
30 sec
72
X min (2kb/min)
72
5 min
1
12
--
1
3.瓊脂糖凝膠電泳試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍(lán)染料，PCR產(chǎn)物可直接點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
研究背景
1、CTLA4基因信息
小鼠CTLA4基因位于第一號(hào)染色體的1C2區(qū)段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）
人CTLA4基因位于2q33.2。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息
c57bl/6小鼠也被稱為c57 black 6，1921年被培育出來(lái)，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個(gè)特點(diǎn)就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個(gè)完成基因組測(cè)序的小鼠品系。
3、研究背景
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表達(dá)在CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的同源受體，兩者共享在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)的一對(duì)配體，并且在T細(xì)胞活化中介導(dǎo)相反的功能。配體與CD28相互作用，介導(dǎo)T細(xì)胞與T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)共刺激。而配體與CTLA4的相互作用可以介導(dǎo)T細(xì)胞功能的抑制[1]。目前，癌癥免疫療法已成為治療癌癥的有效方法，CTLA4是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的免疫檢查點(diǎn)的靶標(biāo)之一[2]。由于CTLA4功能的重要性，因此在許多臨床前和臨床研究中都對(duì)anti-CTLA4抗體及[3]CTLA4阻滯劑進(jìn)行了癌癥治療的測(cè)試[4-10]。人類和小鼠的CTLA4只具有75.16％的同源性，目前批準(zhǔn)用于臨床的抗CTLA4抗體可以與人CTLA4結(jié)合，但不會(huì)與鼠類CTLA4交叉反應(yīng)[11]。因此，構(gòu)建免疫檢驗(yàn)點(diǎn)人源化小鼠模型，使科研人員能夠研究只識(shí)別人體免疫檢驗(yàn)點(diǎn)的藥物。并且，人源化小鼠為研究靶定人體免疫檢驗(yàn)點(diǎn)的檢驗(yàn)點(diǎn)抑制劑提供了可能性，并且在臨床試驗(yàn)前更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)藥物功效以及可能的副作用（如自身免疫，促炎癥等）。
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模型信息
中文名稱:CTLA4人源化小鼠模型
英文名稱:CTLA4 humanized mouse model
類型:人源化模型
分級(jí):NA
用途:腫瘤抗體治療。
研制單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
保存單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
